PPA，Plant Tissue Culture Preservative Agents  

PPA –植物組織培養(yǎng)抗菌保護劑

使用操作說明

產品名稱:PPA- Plant Tissue Culture Preservative Agents

（植物組織培養(yǎng)抗菌保護劑）

貨號：PPA001-50ml

保存條件：4℃

運輸條件：常溫運輸

性狀：無色至琥珀色透明液體

pH 值：3.8

有效期：見瓶身標簽說明

產品描述：

1.    PPA是一種熱穩(wěn)定的抗菌劑，用于植物組織培養(yǎng)中植物的微生物污染防治與清除；

2.   在合理的使用劑量下，PPA是一種非常有效的植物組培抗菌劑與保護劑，不會對植物的生長（如種子萌發(fā)，愈傷增殖、再生等）產生任何影響，可視為培養(yǎng)基標準配方成份；

3.   PPA主要用于預防和消除來自空氣、水源或者人體接觸等外界因素導致的植物組培過程中的微生物污染，同時，對于植物內生菌也同樣具有非常好的抑制效果；

4. PPA廣泛適用于絕大多數(shù)被子植物和裸子植物，但是不推薦用于蕨類植物、藻類等水生植物；

5.   PPA具有熱穩(wěn)定性，能直接加入培養(yǎng)基高溫滅菌而不會影響使用效果，使用更加方便；

6.    PPA相對于常規(guī)抗生素而言，性價比更高。

作用機理：

PPA的活性成分能滲透細菌或者真菌細胞壁，抑制呼吸作用中三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈過程中關鍵酶的活性，同時也能阻斷細菌和真菌吸收和利用培養(yǎng)基中單糖和氨基酸的過程，從而實現(xiàn)預防和清除植物組織培養(yǎng)過程中的微生物污染。

相對抗生素的優(yōu)勢：

1.    PPA能廣泛抑制和清除細菌和真菌的污染，并防止真菌孢子的萌發(fā)；

2.    PPA是通過抑制多種酶的活性而達到抑菌效果，從而能避免耐藥突變體的發(fā)生；

3.    PPA具有熱穩(wěn)定性，無需過濾滅菌，能直接加入培養(yǎng)基高溫滅菌而不會影響使用效

果，使用更加方便；

4.    PPA性價比更高，可更加廣泛的應用于更多的科學研究、作物育種、組培苗工廠化

生產中。

以下操作說明是針對大多數(shù)情況下的常規(guī)使用說明，必要時，可根據(jù)具體植物樣本情況進行適當調整。

1.    常規(guī)用量：

一般推薦使用使用濃度為 0.05%-0.2%（1L 培養(yǎng)基中加入 0.5-2 ml PPA）;

愈傷增殖，器官形成，胚性組織發(fā)育等使用濃度為 0.05%-0.075%（1L 培養(yǎng)基中加入 0.5-0.75 ml PPA）。

說明：

(a) 含有 PPA的培養(yǎng)基無需在超凈工作臺中分裝，在培養(yǎng)基凝固以后將培養(yǎng)瓶/皿蓋子蓋好即可。如使用自動灌裝系統(tǒng)，建議在灌裝前后將分裝管用高壓滅菌熱水處理；

(b) 如果培養(yǎng)基儲存液保存在無菌容器中并未經(jīng)污染的情況下，加入 PPA配制的培養(yǎng)基無需再次過濾或者高溫滅菌。如果是營養(yǎng)培養(yǎng)基，如含有 200 mg/L 甚至更高濃度氨基酸或者蛋白質的培養(yǎng)基，建議過濾滅菌。

2.    植物內生菌污染處理：

(a) 種子：PPA不推薦用于直接處理含有大量的細菌或真菌孢子的種子滅菌，對于種子離體萌發(fā)，建議先采用傳統(tǒng)方法消毒，然后置于含 2-3% PPA的全培養(yǎng)基礎鹽溶液中，輕輕攪拌 4-12 小時，此過程千萬不能添加 Tween20 和調節(jié) pH，處理完成以后直接插入含有 PPA (草本植物 0.05-0.1%，木本植物 0.2%)的培養(yǎng)基里；

(b) 外植體：以 1cm 外植體為例，將外植體置于含 4-5% PPA的全培養(yǎng)基礎鹽溶液中，輕輕攪拌 4-12 小時，此過程千萬不能添加 Tween20 和調節(jié) pH，處理完成以后直接插入含有 PPA (草本植物 0.05-0.1%，木本植物 0.2%)的培養(yǎng)基里；

(c) 對于塊莖，球莖和鱗狀物的觀賞植物樣本：將其整體放入傳統(tǒng)消毒劑中攪拌消毒處理以后，用水沖洗干凈，將材料切成薄片，置于含 4-5% PPA的全培養(yǎng)基礎鹽培養(yǎng)液中，輕輕攪拌 4-12 小時，此過程千萬不能添加 Tween20 和調節(jié) pH，處理完成以后無需沖洗直接插入含有 0.1-0.2%的 PPA的培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)。

3.   如果厚的外植體、污染嚴重的植株、種子等樣本經(jīng)過以上處理仍得不到理想效果，可嘗試以下操作：

(a) 將材料浸泡在水中持續(xù)攪拌處理(松軟組織攪拌 1 小時，硬實組織攪拌 2 小時)；

(b) 將材料在含 50%的 PPA全培養(yǎng)基礎鹽溶液中攪拌處理 5-10 分鐘，此過程千萬不能添加 Tween20 和調節(jié) pH；

(c) 無需沖洗，將處理過的材料直接加入到培養(yǎng)基中即可。對于真菌污染，可在培養(yǎng)基中加入適當濃度的 PPA。對于真菌細菌混合性污染，建議在培養(yǎng)的第一個月的培養(yǎng)基中加入 0.05%-0.2%的 PPA。

4.    嚴重污染材料污染去除與搶救（重污染不超過一周）：

(a) 將污染的材料至于流水中用軟刷刷洗，然后置于含 50% PPA的無菌水溶液中攪拌

5-15 分鐘，對于細菌或者混合性污染，建議使用 100% PPA與 0.6 g/L 的檸檬酸無菌水溶液按 1：1 混合的低 pH(2.8-3.2)的酸性溶液處理；

(b) 處理后的材料無需清洗，直接插入含 0.05%-0.25 的 PPA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個月以上，其中前 10 天需要弱光培養(yǎng)；對于一些真菌、孢子和細菌污染隱藏較深，PPA無法接觸到的部位，建議在初步的清洗以后，將材料切開，然后再放入含 50% PPA的無菌水溶液中攪拌 5-15 分鐘處理。

5.    農桿菌的去除：

共培養(yǎng)以后，將樣本用無菌水清洗，然后將樣本浸沒在 100% PPA（補充 4X 的培養(yǎng)基鹽溶液）中處理 2 分鐘，取出后用無菌紙吸干后并置于常用抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 周后，更換到只含有 0.05%-0.075% PPA (無常用抗生素)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

使用注意事項：

1. 在所有 PPA消毒處理外植體的過程中，盡量保證容器的體積足夠大，并使外植體材料所有面積與含 PPA 的處理溶液充分接觸，以保證消毒效果；

2. 如果外植體出現(xiàn)高度氧化現(xiàn)象，不要扔棄，大約 50%的外植體在 4-6 周內即可恢復；

3. 50% PPA的處理溶液可以重復使用但是不推薦，因為使用次數(shù)和效果受外植體的體積與接種密度的影響。將 50% PPA的處理溶液保存在 4oC可適當延長其活性。

4. 如果 50% PPA溶液處理效果不理想，可采用 100% PPA溶液進行處理，處理方法相同，但使用次數(shù)不得超過 10 次。

安全說明：

1. 雖然 PPA是無毒性的，但是在使用過程中還需盡量避免直接與人體皮膚等直接接觸，建議使用時佩戴手套，保持空間空氣流通，如不慎吸入，先馬上因大量純凈水后立即就醫(yī)，如不慎入眼，立刻用大量水沖洗眼睛 15 分鐘，用肥皂清洗 PPA接觸過的皮膚部位；

2.  含 PPA的培養(yǎng)基垃圾處理與常規(guī)培養(yǎng)基處理方法相同。